Paolo Nespoli nasce nel 1957 a Milano. Entra nell'Esercito Italiano nel 1977, diventa sottufficiale e lavora come istruttore di paracadutismo presso la Scuola Militare di Paracadutismo di Pisa. Nel 1980 passa al 9° Battaglione d'Assalto di Livorno e si qualifica come Incursore. Dal 1982 al 1984 è inviato a Beirut, in Libano, con il Contingente Italiano della Forza Multinazionale di Pace. Nel 1985 riprende gli studi universitari e lascia l’esercito. 

Nel 1988 ottiene a New York un Bachelor in Science in Aerospace Engineering e un Master of Science in Aeronautics and Astronautics al Polytechnic University of New York. Torna in Italia e lavora come Ingegnere Progettista a Firenze, dove ha eseguito analisi meccaniche e fornito il supporto per la qualifica delle unità di volo dell'Electron Gun Assembly dell'Agenzia Spaziale Italiana. L'Università degli Studi di Firenze gli riconosce, nel 1990, una Laurea in Ingegneria Meccanica. 

Nel 1991, è entrato a far parte del corpo astronautico europeo dell'ESA, a Colonia, Germania. In qualità di ingegnere per la formazione degli astronauti ha contribuito alla preparazione e allo sviluppo della formazione di base degli astronauti europei ed è stato responsabile della preparazione e della gestione del mantenimento delle competenze degli astronauti. È stato responsabile anche dell'Astronaut Training Database, un software utilizzato per la preparazione e la gestione della formazione degli astronauti. In poco tempo è assegnato al progetto EuroMir presso dell'ESA e al Johnson Space Center della NASA. Successivamente è scelto come astronauta dall'Agenzia Spaziale Italiana e selezionato per il Corpo Astronautico Europeo dell'ESA. 

Nel 1998 si trasferisce al Johnson Space Center della NASA e viene assegnato alla classe di astronauti XVII della NASA. Nel giugno del 2006, Nespoli è ufficialmente assegnato all'equipaggio della missione STS-120 dello Shuttle. Nel 2008 è assegnato alla Spedizione 26/27, una missione di lunga durata sulla Stazione Spaziale Internazionale, terminata a maggio 2011. Il 26 giugno 2015 è stato assegnato all'equipaggio di Expedition 52/53. Il 28 luglio 2017 Paolo torna nello spazio per la terza volta partendo da Bajkonur alle 17.41 (ora italiana) a bordo della Sojuz MS-05 alla volta della Stazione Spaziale Internazionale. Alle 23.54 (ora italiana) la capsula Sojuz attracca ed infine all'1.57 (ora italiana) Paolo fa il suo ingresso nella stazione. Il 14 dicembre 2017 alle 09.27 (ora italiana) Nespoli dopo 139 giorni sulla ISS atterra a bordo della Sojuz MS-05 nella steppa del Kazakistan, la città più vicina al sito d'atterraggio è Dzhezkazgan.

In totale, nelle tre missioni del 2007, del 2010-2011 e del 2017 Paolo Nespoli è rimasto nello spazio per 313 giorni, 2 ore e 36 minuti.