Barbara Mazzolai nasce a Livorno e nella vicina Università degli Studi di Pisa si laurea con lode in Biologia nel 1995. Dal 1994 al 1998 lavora presso l'Istituto di Biofisica del Consiglio Nazionale delle Ricerche (CNR), dove si occupa di tematiche ambientali e in particolare dell'inquinamento causato dal mercurio. 

Prosegue gli studi e fa un master in Gestione e Controllo dell'Ambiente (EMAS) presso la Scuola Superiore Sant'Anna di Pisa (SSSA). Qui diventa assistente di ricerca presso il Centro di Ricerca in Microingegneria (CRIM Lab), dal 1999 al 2004. Al CRIM fonda un nuovo ambito di ricerca sulle "microtecnologie e la robotica applicabili all'ambiente e all'agroalimentare". Dal 2004 al 2009 è ricercatrice di Ingegneria Biomedica presso la SSSA. 

Nel novembre 2009 la scienziata diventa team leader al Centro di Micro Bio-Robotica a Pontedera dell'Istituto Italiano di Tecnologia {IIT) di Genova, dove dal 16 febbraio 2011 ne è nominata coordinatrice. Nel 2011 prende il titolo di dottore di ricerca in Ingegneria dei Microsistemi presso l'Università Tor Vergata di Roma. 

Tanti sono gli studi di frontiera che l'hanno resa protagonista. Primo fra tutti quello sui "Dustbot" ovvero i robot-netturbini, quando era ricercatrice alla SSSA. DustClean che pulisce e disinfetta le strade e Dustcart un omino verde che, dopo aver ricevuto una telefonata, arriva davanti alla porta di casa e ritira il sacchetto dei rifiuti. Nel 2010 Barbara vince il premio "Marisa Bellisario", per l'attività scientifica e di gestione del progetto "Dustbot". 

Altro ambito che vede Barbara in prima linea, riguarda la realizzazione di robot ispirati a piante e animali. Il primo progetto ha visto nascere "Octopus", un polpo robotico che funziona in acqua imitando i comportamenti dell'animale. Nel 2012 inizia un altro progetto, il primo di carattere futuristico finanziato dalla Commissione Europea, in qualità di responsabile scientifico; "Plantoid" si ispira alle piante e punta a creare robot plantoidi in grado di imitare il comportamento delle radici per l'esplorazione del suolo e il monitoraggio ambientale.Nel 2013 riceve la Medaglia del Senato della Repubblica italiana e nel 2015 il premio internazionale Genova: una donna fuori dal coro per le sue ricerche nel campo della robotica bioispirata. Sempre nel 2015 è nominata da RoboHub tra le 25 donne più influenti nel settore della robotica. Da gennaio a luglio 2017 è stata Visiting Faculty presso Aerial Robotics Lab, Department of Aeronautics, dell’Imperial College di Londra.

Barbara Mazzolai è una delle 100 ricercatrici invitate a far parte del progetto “100 Donne per la Scienza”.